Principalele metode de studiere a micro-obiectelor biologice sunt ușoare și microscopie electronică, care sunt utilizate pe scară largă în practica clinică și experimentală. Principalele obiecte de studiu sunt preparatele histologice efectuate din corpurile de animale de laborator (șobolani, câini, iepuri, etc.), cel al obiectelor luate în timpul intervențiilor chirurgicale sau de la cadavre umane la.
Producerea preparatelor histologice constă în următoarele etape principale:
1. Eșantionarea și fixarea obiectelor biologice;
2. spălat, deshidratării și umplerea obiectelor biologice;
3. Prepararea felii;
4. secțiunile colorantă și concluzie.
1 - captarea și fixarea obiectelor biologice. Cerința principală: prelevarea maximă scurtarea materialului, traumatisme minime la țesuturi și pentru a crea condiții optime pentru fixare. anestezie folosit pentru uciderea animalelor de laborator, decapitare, curent electric, etc. Aceasta este urmată de deschiderea rapidă a animalului, extragerea de organe și țesuturi necesare din care instrumentul este ascuțit taie felii mici (5-10 mm 3) și le-a pus în broască. Deplasarea dispozitivului de blocare trebuie să depășească volumul obiect fix de 20-40 de ori. Fixation previne dezvoltarea modificărilor post-mortem în țesuturi, oprindu-le în procese biochimice. Funcționarea fiecărui zăvor sunt procese complexe fizice și chimice, în primul rând, de coagulare (coagulare) proteine. Practica histologică folosind diferite clipuri: simple, conținând un component (formol, alcool, acetonă) și esteri care conțin două sau mai multe componente (fluide Carnoy lui: alcool absolut, cloroform, acid acetic glacial; Zenker lichid: potasiu bicromat, sulfat de sodiu, clorură mercurică formol, apă distilată).
2 - spălare, deshidratare și de umplere a obiectelor biologice. Pentru secțiuni subțiri obiectelor biologice fixe trebuie să fie pregătite în mod corespunzător: face suficient de dense, dar nu fragil. După fixare, piesele au fost spălate sub jet de apă timp de 12-24 ore pentru a elibera dispozitivul de blocare din surplusul. Pentru obiecte, fixate în alcool sau lichid Carnoy, acest pas este omis. După spălare, obiectele trebuie deshidratată și compactat în alcooli de creștere cetate, care sunt utilizate succesiv 50, 60, 70, 90, 96 și 100 de alcool. ilumina în continuare piese, pentru care ele sunt plasate mai întâi într-un amestec de etanol absolut (circa 100) și O-xilen (1: 1), urmat de două până la trei porții de O-xilen pur. După albirea materialului gata pentru impregnare în parafine. În acest scop, obiectele plasate într-un termostat la mai întâi în suspensie (un amestec de părți egale de o-xilen și parafină) la 37 ° C, urmată de două până la trei porții de ceară pur topit la o temperatură de 56 C. impregnată bucăți de parafină lipite blocuri de lemn. Astfel de obiecte biologice preparate pot fi stocate pentru o lungă perioadă de timp în aer liber.
Pentru tratarea țesuturilor dure (oase, dinti) imediat după fixarea și spălarea materialului folosind decalcifierea procedeu utilizând soluție de acid azotic 5,7%. Ca percolarea sărurilor de calciu cu un țesut de acid, solid devin moi, astfel, structura lor histologică este menținută de substanțele organice rămase. piese sub jet de apă după decalcifiere trebuie regândit clătite, apoi deshidratate, ilumineze și umple în parafină.
3 - pregătirea secțiunilor histologice. Pentru sectionarea dispozitive speciale de utilizare - microtoame. Există trei tipuri: sanie, rotative și congelare. Tobogganing microtom produce secțiuni în trepte, rotative - serial, congelare face posibilă obținerea unei secțiuni fixe și non-fixe de material biologic fără prima umplere în parafină. Toate microtoame sunt echipate cu un alimentator de obiect microscopic și un cuțit microtom special.
Secțiunile de parafină rezultate au fost lipite pe o lamelă de sticlă, proteina amestec lubrifiat cu glicerol (1: 1) și se usucă în aer sau într-un cuptor la 37 ° C Secțiunile au fost preparate pe un microtom de congelare este plasat într-o cană de apă distilată și apoi se colorează imediat.
4 - colorație și secțiuni concluzie. Colorarea felii folosite pentru a vedea în mod clar în structura corpului microscop, și se bazează pe compoziția chimică inegală a structurilor tisulare. Pentru un număr mare de coloranți de colorare aplicabile. Toate acestea pot fi clasificate în funcție de origine: vegetală (hematoxilină), animale (carmin), sintetice; (eozină, și altele.) și proprietățile chimice: acide, bazice, neutre.
Capacitatea structurilor colorate cu coloranti bazici numite bazofile. In structura celulei basophilic este un nucleu ce conține acidul nucleic. Prin coloranți bazofilici includ hematoxilină, carmin, tionina. Structurile colorate cu coloranți acizi, numite oxyphilous, de exemplu, citoplasmă celulelor. Coloranți acizi sunt derivați de acid sau sărurile lor (eozină, fucsin acidă). Coloranți neutre (albastru tripan, roșu neutru).
Există, în plus, coloranți specifici. De exemplu, fibrele elastice sunt colorate orseinom de culoare roșu-brun, rezorcină-fucsin - albastru închis, aldehidă fucsin - violet închis. Grăsimi și substanțe solubile în grăsimi în celulele colorate cu sudan III portocaliu, osmiu pete de grăsime aceleași negru. Pentru a identifica elementele sistemului nervos metoda de impregnare cu nitrat de argint.
Inainte de orice colorarea secțiunilor de parafină sunt îndepărtate, un proces numit deparafinare. În acest scop, secțiunile au fost realizate secvențial în trei porțiuni de O-xilen, alcooli Cetatea downlink (de la aproximativ 100 până la aproximativ 70) sunt apoi introduse în apă distilată. secțiuni congelate nu necesită deparafinare.
Preparat în acest fel felii poate fi colorat aproape orice colorant. Cele mai frecvent utilizate H & E pata. Ce secțiuni au fost plasate în soluție hematoxilin timp de 3-5 minute, apoi in apa de la robinet - pentru clătire și diferențiere. Dupa achizitionarea nuclee de celule roșii (monitorizate microscopic) produc soluție de colorare eozină pentru 0,5-1,5 minute, spălate cu apă distilată și deshidratate în alcooli de creștere a tăriei (de la aproximativ 70 până la aproximativ 100). Mai mult, pentru a îndepărta alcoolul și înălbirea secțiuni plasate succesiv în trei porțiuni O-xilen și încorporate în Canada balsamul.
În unele cazuri, pregătirea condițiilor de prelucrare nu pot veni în contact cu alcooli, o-xilen (de exemplu, colorarea grăsimii), ceea ce face necesară încheierea unui mediu miscibil cu apa: glicerol, glicerol-gelatină și altele.