Secvențierea genomului uman. Strategia de secventierea genomului uman. clona de amprente.
Conceptul de „proiect“ se referă în primul rând la faptul că succesiunea nu este continuă - există lacune.
Deoarece aceste lacune destul de mult, este imposibil să se aranjeze în ordine și să orienteze multe mici ordine secvențiat.
secvențiere incompletitudine. Firește, în timp ce prezintă probleme pentru identificarea genelor bolii ereditare, gene unice si alte structuri genetice.
Trebuie remarcat faptul că, în ultimul sfert al secolului XX. au secvențiat genomul de 599 de virus și viroizi, plasmizii 205, 185 organite, 31 specii de ciuperci eubacteriile 1, 2 animale și mai multe alte genomuri. Experiența dobândită ca urmare a acestei lucrări a fost utilizată pe deplin în secventiere a genomului uman.
Strategia de secventiere a genomului uman in proiect publice include obținerea hărților genetice și fizice ale genomului uman, introducerea ulterioară a acestor carduri rezultate ale secvențierea clonelor individuale ale ADN-ului genomic (secvențierea „clona de clona“ strategie). Această abordare, potrivit organizatorilor programului, pentru a evita erorile în secvențiere, în special în zonele de repetări.
harta fizica a genomului uman are cadru nituit, care a fost dezvoltat de către Olson înapoi în 1981 Abordarea este după cum urmează. Gene a fost tăiat în segmente, fiecare conținând 150.000 bp prin digestie parțială cu endonucleaze specifice site-ului. Aceste segmente mari de ADN au fost plasate în cromozom artificial bacterian (BAC) și introdus în bacterii, în cazul în care acestea sunt copiate la fiecare diviziune bacterii. Rezultatul a fost clone identice ale moleculelor de ADN.
Astfel de clone care acoperă genomul uman, ar trebui să fie de aproximativ 20, 000. Fiecare clonă a fost complet digerat cu o endonuclează de restricție selectată pentru a produce modelul caracteristic de fragmente mici sau clone de amprente.
Compararea modelelor de site-uri de restricție permite să detecteze suprapunerea dintre clone, ceea ce a făcut posibil să se stabilească pozițiile lor relative și de a construi în ordine. Mai mult, pentru stabilirea ordinii de clone utilizate dezvoltate anterior hărți STS (cm. Mai sus). Rezultatul este o harta fizica a genomului.
Clonele individuale BAC au fost tăiate în fragmente și donate. Rezultate donate fragmente secvențiat subclones. De fiecare dată când al doilea venirovali număr mare de subclone identice pentru a fi siguri că fiecare bucată de clone originale BAC analizate de mai multe ori și erori nu sunt permise.
Secvențierea fragmentelor individuale au fost combinate pentru a obține o secvență de nucleotide din fiecare clonă sursă BAC. In cele din urma, intregul secventierea genomului a fost colectat prin compusul SAC secvențelor set care acoperă întregul genom.
Astfel, a creat o hartă a secventiere genomului uman este de 1000 de lacune. Acest lucru se poate datora mai multe motive, în special faptului că clonele originale BAC care acoperă întregul genom, precum suprapunerea dintre clone au fost lipsă datorită prezenței repetitive mari în genom. Creat ca urmare a hărții proiectului de secvențiere include secvențe care conțin o medie de câteva milioane de perechi de baze în lungime.
Segmentele de o astfel de lungime suficientă pentru a cartografia bazată pe clone impune pe alte hărți la o rezoluție mai mică. Pentru acest FISH hibridizare in situ BAC clone a fost utilizat. Poziția pe harta genetică a secvenței secvențializat este definită ca un STS relativ cartografiate.
În general, ordonate si asamblate cu ajutorul unor programe de calculator în întinderi de aproximativ 90% regiuni eucromatină ale genomului. Etapa, cu toate acestea, pot fi luate în considerare pentru secvențierea doar aproximativ 1/4 din genom, în care fiecare pereche de baze secvențiată în medie de 8-10 ori (presupunem că acest număr de repetiții ale fiecărei secvențierea nucleotidelor va fi realizat în secvențierea finală întregul genom uman). In ciuda incompletitudinea secventiere, un număr obținut cu ajutorul rezultatelor acum este de mare interes. Acest lucru se aplică în primul rând la aprofundarea ideilor noastre globale cu privire la organizarea genomului uman.