Citește: Determinarea secvenței de nucleotide de ADN (secvențiere)
1. recombinat ADN (himeric)
Produs de ingineri genetice ADN recombinant numit himeric. Ele au fost create pentru o varietate de scopuri, inclusiv pentru expunerea direcționată la HIV. În ultimii ani, numărul de studii în acest domeniu este foarte mare. Unul dintre circuitele testate folosind ADN himeric este după cum urmează. Pentru o genă care codifică un receptor de proteină CD4. „Hem“ o altă genă care asigură sinteza plantelor din ricin proteină. Ricină în Evul Mediu a fost folosit ca o otravă puternică. Odată ajuns în celulă, sinteza proteinelor blocheaza în citoplasmă, prin aceasta ucidere. După introducerea în celulele un ADN recombinant în final formarea unei proteine himerice codificată de aceasta. Acea parte care corespunde unui receptor de proteină, asigură strict legarea specifică a himerei la celulele de pe suprafața care conține o proteină virală CD4. Cealaltă este o toxina ricin si ucide celulele la care o moleculă himerică. Astfel, o parte din himerei oferă o căutare direcționată în corpul celulelor infectate cu un virus, iar cealaltă parte este uciderea acestora. Schema este destul de simplu și eficient. Ca „criminal“ poate fi folosit nu numai gena de ricină, dar, de asemenea, unele alte gene.
O altă abordare pentru lupta împotriva HIV se bazează pe capacitatea anumitor proteine virale (Tat și Rev), este extrem de important pentru reproducerea HIV în celule care se leagă în mod specific la regiuni specifice ale moleculelor de ARN viral. Pentru a preveni acest proces vital, sa propus să se introducă în celulele infectate sintetizate artificial ARN care conțin situsurile de legare a proteinelor virale. Proteinele virale oricum, ce comunica - cu un ARN viral, sau exact aceeași „copie“ construite art. Adăugat la celula în număr mare, „copie“, în acest caz, joacă rolul de „capcană“: dacă este mult, o proteină a virusului se va lega în principal cu ea, nu cu ARN-ul viral, și, ca urmare, HIV încetează să se propage.
Teoretic, aceste abordări sunt foarte atractive. Și, după cum arată testele, în celule izolate, ele funcționează foarte bine. Cu toate acestea, nu există metode sigure de a livra și de a asigura o operațiune de lungă himerici „constructe“ în întregul organism.
Recent, a fost raportat că crearea altor „himere“ de HIV prin enfervirtid medicamente antiretrovirale.
Enfervirtid este un fragment scurt de gp41 de proteine HIV. care, în ciuda faptului că este un fel de virus „nativ“ previne „merge“ cu celula. Bazat pe șoareci retrovirus virus himeric construit, care este capabil de celule umane pentru a produce un astfel de scurt fragment de proteină HIV și „stand“ pe suprafața celulei infectate cu virusul himeric. Ca urmare, HIV nu poate intra în celule, chiar și în prezența tuturor receptori și co-receptori. Astfel, fragmentul proteic viral acționează ca un „scut“ împotriva virusului întreg. Este foarte important ca protecția este declanșată într-un stadiu foarte incipient al infecției cu celule. La urma urmei, atunci când virusul a pătruns deja în ea, pentru a face față cu ea este aproape imposibil. A început în studiile clinice ale noilor „himere“, potrivit cercetătorilor, având în vedere rezultatele foarte încurajatoare.
2. Construcția ADN-ului recombinant
Sub înțeleagă ADN recombinant format prin combinarea in vitro (in vitro) a două sau mai multe fragmente de ADN izolate din diferite surse biologice. Cheia în această definiție sunt cuvintele „fragmentul ADN“ și „asocierea in vitro“, care indică natura ingineriei genetice, și diferă de toate celelalte metode de producere hibride (sau himerice) organisme, cum ar fi selecția genetică, inginerie embrionara, etc.
fragmente de ADN, incluzând fragmente care conțin gene care a fost preparat folosind enzimele de restricție enzime. Enzimele de restricție pot forma ambele fragmente cu capete boante sau lipicioase. Reticularea fragmentelor ADN produse prin trei metode principale, în funcție de care capetele sunt fragmente de ADN reticulabili.
Reticularea același nume „lipicios“ capete (restricție enzimatică metoda ligazei)
Această metodă este cea mai comună și popular. Pentru prima dată în acest ADN mod hibrid a fost obținut de S. Cohen și colaboratorii în 1973. Unele enzime de restricție, cum ar fi Pst I, introducerea de ADN simetric dispuse pauze în lanț oblic în afară, la distanțe egale de centrul site-ului de recunoaștere și de a forma un „pas“ (vezi Fig. 36). Aceste porțiuni complementare între ele tind să fie asociate din cauza împerechere, și de aceea ele sunt numite sau capete adezive complementare. împerecherea de baze are loc doar între secvențele complementare, așa-Aatt capetele formate Eco RI, nu se vor împerechea, de exemplu, AGTST capetelor formate de Hind III. Dar, oricare două fragmente (indiferent de originea lor) formate în aceeași enzimă de restricție, se pot lipi împreună din cauza formarea de legături de hidrogen între nucleotide ale unor porțiuni monocatenare complementare (Fig. 39).
Cu toate acestea, după o astfel de integritate deplină de împerechere dublu helix este restaurat, deoarece cei doi se va rupe în coloana vertebrală fosfodiester. Pentru recuperarea sa, adică capsat, ligaturarea sau firele sunt enzima ADN ligază. Această enzimă într-o celulă vie are aceeași funcție - reticulare a fragmentelor de ADN sintetizate în timpul replicării.
Cross-linking prin "blunt" capete (metoda conector)
Capetele lipicioase nu sunt absolut necesare pentru legarea fragmentelor de ADN. Capetele boante pot fi unite prin acțiunea ADN ligazei, dacă ligază și capetele boante sunt prezente în amestecul de reacție, la concentrații mari. În acest caz, reacția de ligare are propriile sale caracteristici și eficiența sa este mai mică decât pentru reticulare de capete adezive. Primele astfel de experimente au fost efectuate în 1972 de Paul Berg, Universitatea Stanford, Statele Unite ale Americii. Capetele coezive pot fi de asemenea atașate enzimatic pentru moleculele de ADN cu capete boante. În acest scop, enzima - transferază terminală din timus de vițel care se atașează nucleotide la capătul 3“al lanțurilor de ADN. Dacă un capătul 3 'al unuia dintre recombină în fragmente de ADN in vitro prin terminale finisaj deoxinucleotidil mono-catenar oligo (dA) anumită lungime -segmenty, iar capetele celuilalt fragment - oligo (dT) -segmenty aproximativ aceeași lungime, apoi să se amestece astfel obținut fragmentează mod împerechere are loc prin formarea de legături de hidrogen între oligo (dA) - și -sequences oligo (dT) (Figura 40.). Pentru cuplarea covalentă a celor două fragmente folosind ADN ligaza. Aceste proceduri formează baza pentru a doua metodă generală de preparare a moleculelor de ADN recombinant.
După cum se poate forma vzaimokomplementarnye suficient de lungă capete monocatenare, molecule hibride sunt produse cu eficiență ridicată. În special, astfel încât atunci când clonarea copii ADN ale ARNm, care sunt disponibile în cantități limitate, de obicei, un conector is¬polzuyut metodă. Cu această metodă de conexiune între porțiunile de fragmente încorporate AAAA. O astfel de secvență TTTTT suplimentară poate influența funcția moleculelor conectate și, prin urmare, atunci când este posibil, pentru a obține molecule de ADN recombinant sunt capete adezive formate ca urmare a enzimelor de restricție.
Reticularea fragmente cu capete lipicioase oppositely
În situațiile în care doriți să cusatura fragmentele formate prin diferite endonucleaze de restricție, precum și cu diferite, care este non-complementare între ele capete adezive, folosite așa-numitele linkerii (sau „adaptor“). Linkerii - chimic oligonucleotide sintetizate reprezentând situsuri de restricție, sau o combinație a acestora. Pentru prima dată, această idee a fost propusă de Scheller și co-lucrătorilor în 1977.
Există colecții mari de astfel de „adaptoare“ de gene. Bineînțeles, atunci când se utilizează linkeri ar trebui să fie luate în considerare necesitatea de a respecta regulile de expresie a informației genetice. De multe ori în mijlocul verigii pune un element genetic regulator, de exemplu, un promotor sau un site asociat cu ribozomi. În acest caz, linkerii oferă nu numai gene unire, ci provoacă exprimarea acestora. Acolo linkeri „tocit end. - capăt adeziv“
Dacă este necesar, capetele lipicioase pot fi convertite în tocit. Acest lucru se realizează fie prin scindarea capetelor adezive cu o enzimă - endonucleazică S1, care distruge numai ADN-ul mono-catenar sau capete coezive „construite“, adică folosind ADN polimeraza I pentru a sintetiza capetele monocatenare coezive ale catenei a doua.
Citește: Determinarea secvenței de nucleotide de ADN (secvențiere)
Informații despre activitatea de „ADN-ului recombinant (himeric)“
Setul de gene legate de un control al allogruppu cromozom numit haplotip. Semnificație: 1) studiul cauzelor și a dinamicii variabilității genotipice, baza geneticii evolutive; 2) clarificarea originii individuale a animalelor; 3) determinarea mono- și dizigoți; 4) construirea de hărți genetice de cromozomi; 5) utilizarea sistemelor biochimice genetice.
vectori de expresie. 2.2 Metode pentru introducerea directă a genei în introducerea directă celulă a genei în celulă este realizată în mai multe moduri: 1. Transfectarea 2. Microinjection 3. Electroporation 4. Metoda „mini-celulă“ 5. Pachet în tun lipozomi de electroni 6. în transfecției ADN adsorbit pe cristale de fosfat de calciu (Graham Van der Eb.