Ris.1.2.1. Omogenizatorul cu ultrasunete (a), omogenizatorul magnetic (b)
După obținerea extractului care conține enzima investigată, este supusă purificării. Toate metodele de amestecuri de separare bazate pe faptul că componentele partajate, ca rezultat al oricăror manipulări apar în diferite părți ale sistemului și pot fi separate mecanic unul de altul. Izolarea proteinelor individuale este un proces pas cu pas, deoarece la primele etape de purificare a fracțiunii conțin o mulțime de impurități. La fiecare etapă de separare, trebuie obținută o fracțiune mai bogată în substanța necesară decât cea precedentă. Acest proces este deseori numit fracționare. La fiecare etapă de separare, proteina este fie sub forma unei soluții, fie ca un precipitat.
Imediat înainte ca enzimele să fie purificate, soluțiile proteice sunt concentrate. Aceasta se poate face prin metode: a) precipitarea, urmată de dizolvarea într-un volum mai mic; b) adsorbția pe un schimbător de ioni urmată de eluție; c) ultrafiltrarea. După sau înainte de concentrația preparatelor proteice efectuate de dializa lor, care rezultă din eșantionul de o membrană semipermeabilă elimină compuși cu greutate moleculară mică, care sunt substituite cu tampon. Moleculele Dializa dizolvat de substanțe cu greutate moleculară mică trec prin membrana semipermeabilă, și în imposibilitatea de a dializează particulele coloidale rămân în acesta (Fig. 1.2.2). Cel mai simplu dializator este un sac de collodion (material semipermeabil) în care este localizat lichidul dializat. Punga este imersată într-un solvent. Treptat, concentrația dializatului în lichidul și solventul dializat devine egală. Schimbând solventul, puteți obține o purificare aproape completă a impurităților nedorite. Viteza dializei este extrem de scăzută. Pentru a accelera dializa, măriți zona membranei, măriți temperatura și efectuați o schimbare continuă a solventului. Extractul, care a suferit dializă, numesc dializat.
Fig. 1.2.2. Cel mai simplu sistem de dializă
În stadiul inițial de purificare, tratamentul termic este uneori folosit pentru separarea proteinelor. Este eficient dacă proteina este relativ stabilă sub încălzire, în timp ce proteinele însoțitoare denaturează. PH-ul soluției, durata tratamentului și temperatura variază.
După efectuarea primelor etape de purificare, proteinele din extract diferă una de cealaltă în ceea ce privește solubilitatea, greutatea moleculară, mărimea încărcăturii moleculare totale, stabilitatea relativă etc. Aceste diferențe sunt folosite pentru separarea suplimentară a proteinelor.
Metoda clasică de separare a proteinelor este metoda de separare a acestora pe baza diferitelor solubilități. Pentru a precipita, este necesar să se reducă solubilitatea proteinei într-un fel. În general, solubilitatea proteinelor depinde de capacitatea lor de hidratare. În proteine globulare solubile în apă, un nivel ridicat de hidratare este asigurat de aranjarea grupurilor hidrofile pe suprafață. Adăugarea de solvenți organici scade gradul de hidratare și conduce la precipitarea proteinelor. Principiul acestei metode este că, pe măsură ce crește concentrația solventului organic, abilitatea apei de a solva moleculele hidrofilice încărcate ale enzimei scade. Solubilitatea proteinelor scade la un nivel la care încep agregarea și precipitarea. Un parametru important care afectează sedimentarea este dimensiunea moleculei proteice. Cu cât molecula de proteină este mai mare, cu atât este mai mică concentrația solventului organic care cauzează precipitarea proteinei.
Proteinele sunt, de asemenea, precipitate cu ajutorul sărurilor, de exemplu, sulfatul de amoniu. Această metodă se numește salting out. Sarerea cu adăugarea cantității necesare de sare reprezintă o modalitate eficientă de concentrare. Principiul acestei metode se bazează pe faptul că, prin creșterea concentrației de sare din soluție este comprimată proteină contraionilor specii ionice formate care contribuie la convergența distanța critică la care forțele intermoleculare sunt van der Waals forte atractive depasesc repulsiv Coulomb forte contrari. Aceasta duce la coalescența particulelor de proteine și la precipitarea lor.
Pentru izolarea proteinelor se folosește și metoda de depunere izoelectrică. Taxa proteinelor se datorează în principal asparatata și glutamat reziduuri (sarcină negativă) și lizină și arginină (încărcate pozitiv). Odată cu creșterea pH-ului proteinelor în diferite moduri taxa variază de la valori pozitive la valori negative, iar punctul izoelectric este egal cu zero, în care proteina își pierde atmosfera ionică și particulele se lipesc între ele, precipitare.
Proteina precipitată este separată prin filtrare sau centrifugare. Particulele precipitate materialul prin forța centrifugă sunt depozitate pe fundul paharului centrifugă și este comprimat într-un precipitat dens. centrifugă de mare viteză (ultracentrifugă) creează o accelerație centrifugă despre 100000g, permițând asedieze mari de agregate supramoleculare - ribozomi și viruși.
Cu ajutorul metodei de filtrare pe gel, proteinele pot fi separate rapid, în funcție de mărimea lor. Suportul pentru cromatografie este un gel care constă dintr-o rețea moleculară tridimensională reticulată formată sub formă de granule. Cu cât sunt mai mari legăturile încrucișate, cu atât dimensiunile găurilor sunt mai mici. Gelul acționează ca o sită moleculară. Când soluția este trecută printr-o coloană umplută cu granule Sephadex, particule mai mari decât dimensiunea porilor Sephadex se vor mișca rapid. Moleculele mici se vor mișca încet, deoarece în timpul mișcării vor pătrunde în granule (Figura 1.2.3).