stem embrionare (ES) celule: informații generale
Celulele stem embrionare (celule stem embrionare): celule nediferentiate derivat dintr-un embrion timpuriu, care poate menține o replicare de lungă durată și transforma într-o varietate de tipuri de celule diferențiate. Celulele stem servi ca o sursă constantă de celule noi. La transferul la un alt embrion timpuriu ele pot fi combinate cu masa celulară internă a embrionului și incluse în procesul de dezvoltare, oferind animalelor himerice. Acestea pot fi incluse în numărul de celule de drum germinale.
Culturile primare ale acestor celule sunt obținute din celule blastocist (masa de celule din interior) sau din celulele germinale primordiale embrioni timpurii după implantare. Când cultivate pe un strat de alimentare de fibroblaste embrionare PGCs stocate într-o stare nediferentiata de la 3 luni. până la 1 an. Cu toate acestea, ele pot fi înghețate în mod repetat și decongelate, fără a pierde capacitatea de a diferenția. ESC a impus blastocoel (cavitatea blastocist), păstrează totipotența lor și pot participa la formarea de aproape toate primordii embrionare si organe ale embrionului in curs de dezvoltare. Rezultatul este un animal de companie - himera - constând din clone de celule de două tipuri diferite: original genotipul celulei de bază și ESC. Dacă aceste celule sunt diferite, de exemplu, gene de culoare strat, himera animal - va avea o transversal sau colorație marmorat. La toate animalele, obținute în mod independent, prin introducerea în același genotip embrioni din aceeași linie celulară ar diferi unul de altul prin natura pestriț ca toate himere diferă în setul de clone de celule care s-au dezvoltat și diferențierea de embrion impus ESK . animale himerice în care hESCs se diferențiază în celulele germinale și a dat naștere unei drepturi depline gârneți mature va trece în mod constant urmașilor lor informația genetică conținută în CES. Astfel de animale sunt numite uneori emițătoare de germeni. Prin încrucișare cu șoarecii de tip sălbatic de urmași vor avea heterozigoți pentru gene mutante ESC, t. E. Va transporta o mutatie in stare haploidă in fiecare tip de celule. Acest lucru se aplică în mod egal mutațiile introduse anterior în mod artificial în PGCs. Prin trecerea acestor heterozigotii, puteți obține animalele homozigote pentru o anumită mutație. Desigur, acesta din urmă poate fi realizată numai în cazul în cazul în care mutația nu va letale în stare homozigotă la animalele din această specie.
Capacitatea de a efectua selecția clonelor mutante relevante sau PGCs transgenice și numai apoi să le utilizeze ca vectori de celule a fost utilizat pe scară largă în modelarea genetică. Inițial, în acest scop, hESCs tratate cu diverse mutageni (etilnitrozomochevinoy) clone selectate de celule care poartă mutația în gena dorită, și apoi le folosesc pentru a genera himere prin injectare Gardner. În acest mod a fost obținut la șoareci model de boală Lesch-Nyhan - mutația gipoksantinfosforiboziltransferazy [Hooper M. și colab. 1987].
Cazurile de integrare stabilă a ADN exogen poate fi identificat cu ușurință atunci când transfectate cu o plasmidă sau un vector care conține o genă marker de selecție. Cel mai adesea folosit ca neo gene marker procariotă. raportarea rezistentei celulelor la neomicină. Celulele în care integrarea a avut loc o astfel de plasmidă în ADN-ul cromozomial va forma clone stabile când sunt crescute pe mediu G418, neomicină conținând, în timp ce toate celelalte celule clone se vor degrada în aceste condiții.
Ia blastocist 4.5 zile. Masa celulară internă a blastocistului pus pe un monostrat de celule care alimentează matrice pentru factorii de atașare și de creștere (așa-numitul alimentator, celule de alimentare).
Factorii de creștere susțin caracterul de celule stem pluripotente. inhibarea diferențierii lor. În astfel de circumstanțe, celulele masa de celule interioare proliferează într-un moment adecvat a fost îndepărtată cu ajutorul unei micropipete.
Se dispersează derivate din celule și placate pe strat de alimentare proaspăt. Coloniile examinate la microscop și selectat pe cele care au o morfologie caracteristică a coloniilor de celule ES Ia corespunzătoare. resuspendat și etalate pe un strat de alimentare. Celulele ES colonii Se obține astfel păstra pluripotența și capabile să producă animale himerice.
Să facem un experiment, prezentat schematic în fig. 6.
Ia-derivate celule stem embrionare de la soareci homozigota negru și introduce în blastocistului mouse-ul, homozigot pentru alela albinos.
Hoisted blastocist pseudoînsămânțare mouse-ul și ea să dea naștere la urmași. Puii sunt obținute șoarecii himerici care conțin celule, cum ar fi - descendenții lui homozigot negru și alb-descendenții celulelor homozigote. Sa înțeles? Pielea acestor soareci va fi reperat. Acest loc este un semn de chimerism.
himerele incrucisati obținute cu albinoși homozigote. Puii obține un anumit număr de șoareci negri. Aceste soareci negru primite ca urmare a faptului că unele celule podsazhennyh stem embrionare de la un mouse negru incluse informațiile conținute în celulele de linie germinativa de descendenți. Acesta este un rezultat foarte important, arătând că această abordare poate fi utilizată pentru a crea animale transgenice.
Acum puteți utiliza ES-celule pentru a introduce ADN-ul străin în ele. Acest lucru se poate face în diferite moduri, de exemplu, prin electroporare sau prin retrovirusuri. De obicei, utilizați prima. Și apoi este aceste celule au fost selectate, care au menținut și au primit ADN străin stabil. După selectarea celulelor dorite in vitro, noi le introducem în mouse-ul exact așa cum a fost spus doar că. clone de celule transduse rămân pluripotente în natură.
Ai deja clar că am revoluționat întregul proces? Mai degrabă decât animalele transgenice selectați, am selektiruem celule stem folosind genetica de celule somatice bine dezvoltate. A se vedea organisme transgenice :. Utilizarea de linii de celule ES și EK