Scopul clase: pentru a studia testele serologice (aglutinare), performantă tehnică și rezultatele contabile
Materiale si echipamente. ser, tuburi trepied, ac, placă pentru RA.
Esența este că adăugarea de ser conținând anticorpi specifici de antigen din suspensia celulară uniformă se produce lipire, formarea de bulgări, aglomerări, care se acumulează treptat pe fundul tubului, formând un precipitat caracteristic - lichid aglutinează deasupra este decolorat. În cazul în care antigenul este o suspensie bacteriană fixă (fără flageli) având precipitat fin numai somatic O-antigen format în timpul 16-22ch. În cazul în care antigenul este o suspensie de bacterii având flageli (specii mobile) și participă la aglutinarea împreună cu somatic încă flagelar H krupnohlopchaty antigen format, agglutinates grosier.
In practica veterinară, RA este utilizat pentru diagnosticarea bruceloza, salmoneloza, colibaciloză, listerioză, Vibrioza, leptospiroza si alte boli. Există mai multe producție metode RA: tub-test (volum), picătură (placă), sânge-picurare, hemaglutinării (WGA), inhibarea hemagglutination (HAI), Coombs antiglobulină, RA Kastelani (aglutinină metoda de adsorbție), o probă inelară de lapte.
Antigeni polivalenta - au receptor determinant multiplu pentru un anticorp și poate reacționa cu ele în corpul animal (in vivo), cât și în afara corpului - in vitro (in vitro).
Anticorpi - proteine macromoleculare fracțiune globulină de ser (imunoglobuline). Prin manifestarea fenomenului interacțiunii dintre antigen și anticorpii in vitro se disting: sedimentar (direct) de răspuns, lysing și neutralizare. Anticorpii implicați în reacțiile sedimentare sunt numite prin interacțiunea lor cu antigenul: aglyutininy-cauza legarea antigenului corpuscular - aglyutinogena și precipitarea antigenului - anticorp (aglutina); Formă pretsipitiny precipitat cu antigenul solubil - pretsipitinogenom.
Reacțiile serologice sedimentar apar în două faze: prima - un specific, invizibile cu ochiul liber, atunci când apare formarea antigenului - anticorp, faza a doua - nespecifice (fizico-chimic) - efectul final se manifestă - rezultat vizibil, precipitarea aglutinează.
In testele serologice practica veterinară și medical ca o boală infecțioasă tehnicile de diagnosticare sunt aplicate: 1) determinarea, identificarea (calitativă și cantitativă) a anticorpilor din serul animal printr-un antigen cunoscut și deliberat; 2) determinarea antigenului specific folosind cunoscut cunoscut seruri hiperimune specifice (antrax, Salmonella, bruceloza și colab.), Stabilirea speciilor (variante) aparținând agentului patogen izolat din materialul de testare (identificare serologică).
Testele serologice sunt de asemenea folosite pentru a estima corpul animalelor imunitatea dobândită în mod natural și artificial. Serologică a pus pe soluție fiziologică de NaCl deoarece a doua faza are loc în mediu slaboelektrolitnoy.
Pentru determinarea anticorpilor serici (printr-un antigen cunoscut) este mai întâi sângerat (5- 10 ml) din vena jugulară a animalului (de la coadă la porci), în eprubete sterile și a pus într-un loc cald. După formarea de cheag-l cu atenție separat de pereții tuburilor, încercuiesc steril sârmă de metal (ace de tricotat disponibil) și pus într-un loc rece pentru retragere. Serul a fost aspirat în tuburi sterile, ultima sunt numerotate și trimise prin curier și o scrisoare de intenție în laborator. In RA (precum și cu studiile serologice) sau folosind ser proaspăt fără hemoliză sau fenol conservat, mertiolat, acid boric.
Antigen pentru RA este o suspensie în ser fiziologic ucis sau bacterii vii. Pentru scopuri de diagnostic, trebuie să utilizați antigenul standard. În cazul în care este necesar pentru a identifica cultura bacteriană izolată din materialul patologic, utilizează serul standard și antigenul este preparat dintr-o cultură de peste noapte - la același nivel cu IPA.
Echipament de setare RA 0.1), în starea de tuburi pune 5 într-un rând. Numărul de rânduri depinde de numărul de probe de seruri primite pentru testare. Tuburile semn sus (numerotate) pe sticla cu creionul. 2) Se prepară diluarea primară a fiecărui ser de testat, precum și un control - seruri pozitive și animale normale (de exemplu, bovine). În acest scop, primul tub este realizat dintr-un număr de 2,4 ml ser fiziologic și 0,1 ml de ser (01:25). 3) Se prepară diluarea fiecărei probe de ser de lucru: a 3, 4, 5 ale tuburilor toate rândurile este realizat de 0,5 ml de soluție salină. Apoi, din pipeta primul tub de măsurare (folosind „pere“) este transferat la tuburile de testare doua și a treia în 0,5 ml din diluarea serului. Al treilea ser tub Adăugând amestecat cu ser fiziologic plasat în ea (obținut prin diluarea 1:50). Din al treilea tub de 0,5 ml de ser a fost transferat la al patrulea, se amestecă (diluție devine 1: 100) și 0,5 ml se transferă într-un tub cincea (diluție 1: 200). 0,5 ml de ser diluat a fost turnat într-un vas cu o soluție dezinfectantă din ultimul tub. Astfel, în al doilea, al treilea, al patrulea și al cincilea tuburi rămase 0,5 ml de ser sanguin diluat 1:25, respectiv, 1:50, 1: 100 și 1: 200, adică am primit în serie de două diluții din fiecare probă de ser. 4) Tuburile conținând seruri diluate introduc antigen, diluat în prealabil cu soluție salină în concentrațiile dorite de NaCl (bruceloza singur antigen diluat 1: 10 până la 1 miliard de organisme microbiene în 1 ml), făcându-l calibrat pipetă 0,5 ml în fiecare tub. Ca rezultat, diluția serică finală sunt de 2 ori mai mare (concentrația de 2 ori mai puțin) - 50,1 4. respectiv. 100, 1. 200, 1. 400, și în fiecare eprubetă totalul componentelor a fost de 1 ml. nu se adaugă mai întâi flaconul de antigen, servește ca un control al calității ser de testat. Componentele în formularea RA introduse în flacoane separate (individuale) volumetric pipetă (folosind pere cauciuc) sau dozatoare de grup. După adăugarea serului de testare și de control cu tuburi Tripozi antigen scuturate ușor și plasate într-un incubator timp de 16-20 ore (37-38 ° C) și apoi incubate timp de 1-2 ore la temperatura camerei, după care se iau în considerare reacția de aglutinare.
RA contabilitate efectuate cu ochiul liber (vizual) sau prin seroscopy în fiecare tub, pornind de la comenzile. Dacă există fulgi de fibrină, celule roșii din sânge și impurități în tubul de primul test au prezentat un număr de RA nu ia în considerare. Rezultatele RA determinate în încrucișări după cum urmează:
++++(#) - lichid plin iluminare peste complet stabilit pe fundul tubului este sub formă de agglyutina dezvăluite parasolar dantelă albă inversat. Când scuturarea din nou umbrela, descompus în fulgi și bulgări, iar lichidul rămâne limpede. Se crede că au existat 100% aglutinare
+++ (+++) - educație incompletă lichid, dar umbrelă bine definită (75% -s aglutinare). Când scuturarea aglutineze este rupt în fulgi, bucăți, bucăți; Lichid ușor tulbure;
++ (Două cruci) - albire lichid este exprimat moderat umbrela marcate (50% aglutinare), prin agitarea sedimentul este împărțit în smocuri și noduli mai mici, lichide turbiditate;
(+) - abia perceptibil umbrelă lichid de albire slab exprimat, prin agitarea sedimentul este rupt în fulgi și o cantitate mică de bulgări (o aglutinare de 25%) lichid clar turbiditate;
- (minus) - lichid de albire și formarea umbrela sunt absente, în partea de jos a tuburilor la centrul vizibil „sau moft“ un buton „- o peletă de celule compacte antigen (microbi) sunt rupte prin agitare într-o suspensie tulbure uniform.
Indicatori de aglutinarea în tuburi pentru două, trei sau patru cruci sunt caracterizate ca reacție pozitivă. Ultima diluție a serului în care aglutinării cu estimările pentru două, trei și patru cruce, potrivit titrului său. Evaluarea diagnostică a reacției de aglutinare este efectuată ținând cont de gravitatea unei cruci și titruri sale înălțime (la diferite boli diferite).
Diagnosticul serologic sunt mai multe opțiuni declarație de RA - reacția microagglutination. atunci când rezultatul este luată în considerare în picătură lichid sfărâmată pe o lamă de microscop. Luând o pipeta picătură din tubul de testare în care sunt conectate serul și antigenul. Aplicarea în practică a acestei reacții se găsește în diagnosticul de leptospiroza, ser pregătește BioIndustry. Eliberarea într-o formă uscată (liofilizată).
In medicina veterinara, reacția Coombs dezvoltat pentru diagnosticul brucelozei bovine sub forma variantelor bacteriene.
Metode de formulare de reacție Coombs. Componentele de reacție; antigen bruceloza (spălate cu soluție salină de 2-3 ori mai mare centrifugare) sub ser bovin testat, ser antiglobulină. Pre-a pus în RA obicei patru diluții de ser 1: 50: 400. ia în considerare rezultatele și apoi determină titlul final. Tubul cu limită de ser titru este eliminat, iar conținutul acestor tuburi au fost examinate pentru prezența anticorpilor părinte: în aceste eprubete se adaugă 2 ml de soluție salină, conținutul fiecărui tub au fost transferate în tuburi de centrifugă, centrifugate la 4000 rot / min, supernatantul îndepărtat, peleți resuspen-diruyut. 2 ml de soluție salină este centrifugat din nou în aceleași condiții. După a doua jgheabului și îndepărtarea supernatantului, peletul a fost resuspendat în 1 ml de ser antiglobulină (titru în lucru), amestecul a fost plasat într-un incubator timp de 18 ore (37 ° C), apoi se lasă să stea timp de 2-4 ore la temperatura camerei, apoi ia în considerare rezultatul ca în RA convențională. Titrul de funcționare Coombs reacție minimă cu bruceloză bovină considerat) 1: 200, 1: 100 este considerat un rezultat îndoielnic.