Ingineria genetică a plantelor
Construcția de ADN recombinant
Sub înțeleagă ADN recombinant format prin combinarea in vitro (in vitro) a două sau mai multe fragmente de ADN izolate din diferite surse biologice. Cheia în această definiție sunt cuvintele „fragmentul ADN“ și „asocierea in vitro“, care indică natura ingineriei genetice, și diferă de toate celelalte metode de producere hibride (sau himerice) organisme, cum ar fi selecția genetică, inginerie embrionara, etc.
fragmente de ADN, incluzând fragmente care conțin gene care a fost preparat folosind enzimele de restricție enzime. Enzimele de restricție pot forma ambele fragmente cu capete boante sau lipicioase. Reticularea fragmentelor ADN produse prin trei metode principale, în funcție de care capetele sunt fragmente de ADN reticulabili.
Reticularea același nume „lipicios“ capete (restricție enzimatică metoda ligazei)
Această metodă este cea mai comună și popular. Pentru prima dată în acest ADN mod hibrid a fost obținut de S. Cohen și colaboratorii în 1973. Unele enzime de restricție, cum ar fi Pst I, introducerea de ADN simetric dispuse pauze în lanț oblic în afară, la distanțe egale de centrul site-ului de recunoaștere și de a forma un „pas“ (vezi Fig. 36). Aceste porțiuni complementare între ele tind să fie asociate din cauza împerechere, și de aceea ele sunt numite sau capete adezive complementare. împerecherea de baze are loc doar între secvențele complementare, așa-Aatt capetele formate Eco RI, nu se vor împerechea, de exemplu, AGTST capetelor formate de Hind III. Dar, oricare două fragmente (indiferent de originea lor) formate în aceeași enzimă de restricție, se pot lipi împreună din cauza formarea de legături de hidrogen între nucleotide ale unor porțiuni monocatenare complementare (Fig. 39).
Fig. 39. Enzima de restricție de circuit - metoda ligază
Cu toate acestea, după o astfel de integritate deplină de împerechere dublu helix este restaurat, deoarece cei doi se va rupe în coloana vertebrală fosfodiester. Pentru recuperarea sa, adică capsat, ligaturarea sau firele sunt enzima ADN ligază. Această enzimă într-o celulă vie are aceeași funcție - reticulare a fragmentelor de ADN sintetizate în timpul replicării.
Cross-linking prin "blunt" capete (metoda conector)
Capetele lipicioase nu sunt absolut necesare pentru legarea fragmentelor de ADN. Capetele boante pot fi unite prin acțiunea ADN ligazei, dacă ligază și capetele boante sunt prezente în amestecul de reacție, la concentrații mari. În acest caz, reacția de ligare are propriile sale caracteristici și eficiența sa este mai mică decât pentru reticulare de capete adezive. Primele astfel de experimente au fost efectuate în 1972 de Paul Berg, Universitatea Stanford, Statele Unite ale Americii. Capetele coezive pot fi de asemenea atașate enzimatic pentru moleculele de ADN cu capete boante. În acest scop, enzima - transferază terminală din timus de vițel care se atașează nucleotide la capătul 3“al lanțurilor de ADN. Dacă un capătul 3 'al unuia dintre recombină în fragmente de ADN in vitro prin terminale finisaj deoxinucleotidil mono-catenar oligo (dA) anumită lungime -segmenty, iar capetele celuilalt fragment - oligo (dT) -segmenty aproximativ aceeași lungime, apoi să se amestece astfel obținut fragmentează mod împerechere are loc prin formarea de legături de hidrogen între oligo (dA) - și -sequences oligo (dT) (Figura 40.). Pentru cuplarea covalentă a celor două fragmente folosind ADN ligaza. Aceste proceduri formează baza pentru a doua metodă generală de preparare a moleculelor de ADN recombinant.
Fig. 40. Sew capete „lipicioase“ și legarea încrucișată a fragmentelor de ADN
După cum se poate forma vzaimokomplementarnye suficient de lungă capete monocatenare, molecule hibride sunt produse cu eficiență ridicată. În special, astfel încât atunci când clonarea copii ADN ale ARNm, care sunt disponibile în cantități limitate, de obicei, un conector is¬polzuyut metodă. Cu această metodă de conexiune între porțiunile de fragmente încorporate AAAA. O astfel de secvență TTTTT suplimentară poate influența funcția moleculelor conectate și, prin urmare, atunci când este posibil, pentru a obține molecule de ADN recombinant sunt capete adezive formate ca urmare a enzimelor de restricție.
Reticularea fragmente cu capete lipicioase oppositely
În situațiile în care doriți să cusatura fragmentele formate prin diferite endonucleaze de restricție, precum și cu diferite, care este non-complementare între ele capete adezive, folosite așa-numitele linkerii (sau „adaptor“). Linkerii - chimic oligonucleotide sintetizate reprezentând situsuri de restricție, sau o combinație a acestora. Pentru prima dată, această idee a fost propusă de Scheller și co-lucrătorilor în 1977.
Există colecții mari de astfel de „adaptoare“ de gene. Bineînțeles, atunci când se utilizează linkeri ar trebui să fie luate în considerare necesitatea de a respecta regulile de expresie a informației genetice. De multe ori în mijlocul verigii pune un element genetic regulator, de exemplu, un promotor sau un site asociat cu ribozomi. În acest caz, linkerii oferă nu numai gene unire, ci provoacă exprimarea acestora. Acolo linkeri „tocit end. - capăt adeziv“
Dacă este necesar, capetele lipicioase pot fi convertite în tocit. Acest lucru se realizează fie prin scindarea capetelor adezive cu o enzimă - endonucleazică S1, care distruge numai ADN-ul mono-catenar sau capete coezive „construite“, adică folosind ADN polimeraza I pentru a sintetiza capetele monocatenare coezive ale catenei a doua.
Alte capitole din această secțiune: